Suite à la séparation des flux sanguins en flux aortique et pulmonaire, les deux ventricules sont également fonctionnellement distincts. Les parois en expansion des ventricules s'apposent et forment le septum interventriculaire (portion musculaire), qui se développe donc d'abord de façon passive, mais plus tard également de manière active. Il a la forme d'un fer à cheval, concave vers le haut. Sa branche postérieure s'étend jusqu'au bourrelet endocardique dorsal du canal AV, sa branche antérieure se termine à proximité du bourrelet endocardique ventral. Il reste tout d'abord une ouverture entre les ventricules gauche et droit, le foramen interventriculaire (foramen interventriculaire secondaire). Ce foramen est comblé par la prolifération des crêtes dans le conotruncus et du bourrelet endocardique dorsal (portion membraneuse de la cloison interventriculaire). La transition entre le ventricule gauche et la portion aortique du cône cloisonné (foramen interventriculaire primaire) reste cependant ouvert et devient le vestibule de l'aorte.