Lorsque l'axone d'un motoneurone atteint un myotube, le processus de différenciation est alors déclenché des deux côtés. Ce processus est régulé par les échanges d'informations. Le cône de croissance (growth cone) de l'axone se transforme en une terminaison nerveuse, tandis que la surface du myotube en regard de la terminaison nerveuse commence à se différencier de la région non-synaptique. Dans la fibre musculaire embryonnaire, les récepteurs de l'acétylcholine (AChR) se trouvent dispersés sur la surface. Avec l'arrivée de la terminaison nerveuse, les AChR se concentrent en dessous de la terminaison et disparaissent presque totalement de la surface non-synaptique. La maturation subséquente de la fibre musculaire entraîne aussi une surrégulation de l'expression génique de l'AChR dans les noyaux cellulaires situés directement sous la terminaison nerveuse. Cette expression s'estompe dans les noyaux cellulaires situés en-dehors des zones synaptiques. Ceci conduit à une synthèse localisée de l'AChR au niveau des synapses neuromusculaires.
Dans les terminaisons nerveuses, on assiste, à des endroits spécifiques de la membrane pré-synaptique, à une concentration locale de vésicules contenant le neurotransmetteur acétylcholine (ACh). En ces endroits ou zones actives, les vésicules fusionnent avec la membrane cellulaire et déversent leur contenu dans l'espace synaptique. A la surface de la fibre musculaire, juste en face des zones synaptiques, il se forme des replis au niveau desquels la concentration en AChR est particulièrement élevée. La partie synaptique de la lame basale entourant toute la fibre musculaire se spécialise également. L'enzyme acétylcholinestérase s'y enrichit. Elle hydrolyse l'ACh libérée, mettant ainsi terme à l'effet du transmetteur.
Chaque myotube est d'abord innervé par plusieurs axones (innervation polyneuronale). Jusqu'à la naissance ou peu après, toutes les terminaisons nerveuses à l'exception d'une seule sont éliminées. La terminaison restante se développe davantage. Mais cette élimination ne signifie pas forcément une perte d'axones. Les axones éliminés auprès d'une fibre musculaire peuvent toujours s'imposer auprès d'une autre. A la fin de ce processus, on obtient une innervation mononeuronale. Il existe néanmoins des exceptions comme dans le cas des muscles oculaires, qui reçoivent une innervation multiple.