Wenn das Axon eines Motoneurons eine Myotube erreicht, beginnt der Differenzierungsprozess auf beiden Seiten. Dieser Prozess wird wechselseitig durch den Austausch von Informationen gesteuert. Der Wachstumskegel (growth cone) des Axons wird zu einer Nervenendigung umgewandelt, während die Oberfläche der Myotube, die der Nervenendigung gegenüberliegt, sich von dem nichtsynaptischen Bereich zu unterscheiden beginnt. In der embryonalen Muskelfaser sind die Acetylcholin-Rezeptoren (AChR) diffus über die Oberfläche verteilt. Mit der Ankunft der Nervenendigung werden die AChR unter der Nervenendigung konzentriert und verschwinden weitgehend an der nicht-synaptischen Oberfläche. Mit der weiteren Reifung der Muskelfaser wird auch die Genexpression für AChR in den Zellkernen hochreguliert, welche direkt unter der Nervenendigung liegen. In den außerhalb der synaptischen Zone liegenden Zellkernen nimmt sie ab. Das führt zu einer lokalisierten AChR Synthese im Bereich der neuromuskulären Synapsen.
In den Nervenendigungen kommt es an besonderen Stellen der präsynaptischen Membran zu einer lokalen Konzentration von Vesikeln, die den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) enthalten. An diesen Stellen, den aktiven Zonen, fusionieren die Vesikel mit der Zellmembran und setzen ihren Inhalt in den synaptischen Spalt frei. An der Oberfläche der Muskelfaser, unmittelbar gegenüber den synaptischen Zonen, bilden sich Einfaltungen, in deren Bereich die Konzentration von AChR besonders hoch ist. Der synaptische Teil der Basallamina, welche die ganze Muskelfaser umgibt, wird ebenfalls spezialisiert. Dort wird das Enzym Acetylcholinesterase angereichert, welches das freigesetzte ACh hydrolisiert und damit die Transmitterwirkung beendet.
Jede Myotube wird zunächst von mehreren Axonen innerviert (polyneuronale Innervation). Bis zur Geburt oder kurze Zeit danach werden alle Nervenendigungen bis auf eine eliminiert. Die verbleibende Endigung entfaltet sich weiter. Diese Elimination bedeutet aber nicht unbedingt einen Verlust von Axonen. Axone, die an einer Muskelfaser eliminiert werden, können sich an einer anderen durchsetzen. Am Ende dieses Prozesses steht die mononeurale Innervation. Es gibt jedoch einige Ausnahmen wie z.B. die äußeren Augenmuskeln, die multipel innerviert bleiben.